相差顯微鏡（Phase Contrast Microscope）是一種基于光波相位變化的光學成像技術，由荷蘭物理學家Frits Zernike于20世紀30年代發明，其核心目標是將透明樣本（如活細胞、未染色組織）的相位差轉換為可見的明暗對比，主要用于觀察未染色標本。

我們都知道，相差是指同一光線經過折射率不同的介質其相位發生變化并產生的差異。相位指在某一時間上，光的波動所達到的位置。傳統明場顯微鏡中，一般由于被檢物體（如不染色的細胞）所能產生的相差太小，肉眼很難分辨，只有在變相差為振幅差（明暗差）之后才能被區分，而相差顯微鏡則很好解決了這一難題，成為生物學、醫學和材料科學中不可或缺的觀測工具。

二、相差顯微鏡的結構及工作原理

相差顯微鏡通過以下四個關鍵結構實現相位對比成像：

相差物鏡：內含相位板，調制直射光與衍射光的相位差。

轉盤聚光器：集成環形光闌，提供匹配物鏡的環形照明。

合軸調中望遠鏡：校準環形光闌與相位板的同軸性。

綠色濾光片：優化單色光成像，減少多色光相位誤差。

當光線穿過透明樣本時，會因樣本厚度或折射率差異產生相位延遲（相位差），但人眼無法直接感知相位變化。相差顯微鏡通過以下兩步實現相位到強度的轉換：

環形照明：聚光鏡下方的環形光闌形成環形光束，均勻照射樣本。  

相位調制：物鏡后焦平面的相位板對直射光（未散射）和衍射光（散射）施加不同的相位延遲（通常為λ/4）和光強衰減，使兩者干涉后形成明暗對比。  

2. 光學系統架構

相差顯微鏡的光路由以下核心模塊構成：  

照明系統：光源→聚光鏡透鏡組→環形光闌→樣本。  

成像系統：物鏡透鏡組（含相位板）→輔助透鏡→目鏡或相機。  

二、光學系統與工作原理的深度解析

1. 環形照明的實現：轉盤聚光器

結構設計：轉盤聚光器包含多個環形光闌（對應不同倍率物鏡），通過旋轉切換光闌尺寸。每個光闌為金屬薄片上的環形透光孔，孔徑與物鏡相位環嚴格匹配，其作用便是形成空心錐形照明光束，使直射光（未與樣本作用）與衍射光（經樣本散射）在物鏡后焦平面分離，為相位調制創造條件。

2. 合軸調中望遠鏡的功能

校準流程：取下目鏡，插入合軸調中望遠鏡，通過調節聚光器的對中旋鈕，使環形光闌的像與物鏡相位環完全重合。精度要求在環形光闌與相位環的偏移需小于5微米，否則會導致對比度下降或成像不均。

3. 綠色濾光片的技術價值

核心作用：單色化照明：濾光片通常選擇綠色（峰值波長550±10 nm），限制光源波長范圍，避免多色光因波長差異引起的相位延遲波動（相位差Δφ=2πΔn·t/λ，波長λ變化會干擾Δφ的一致性），主要用于提升分辨率，人眼對綠光敏感，且綠光波長適中（500–600 nm），有助于在可見光范圍內平衡分辨率和對比度。

技術參數：

窄帶濾光片，半高寬（FWHM）≤20 nm，透光率>90%（如BP550-15）。

鍍膜工藝：硬質氧化物多層膜（如TiO?/SiO?交替鍍層），確保耐久性與抗眩光性能。

三、核心光學元件的協同設計

1. 相差物鏡：相位板與透鏡組的集成

相位板類型：

正相差（Dark Contrast）：直射光延遲λ/4，吸收70%強度，背景暗、樣本亮。

負相差（Bright Contrast）：衍射光延遲λ/4，背景亮、樣本暗。

物鏡透鏡組設計：

低色差物鏡：采用螢石（CaF?）與BK7玻璃組合，校正色差至<1 nm（在550 nm處）。

高NA物鏡：使用超高折射率玻璃（如LaSFN9，n=1.88）提升數值孔徑（NA=1.4）。

相位板鍍膜：相位延遲層SiO?膜厚精確控制550 nm波長下，λ/4對應膜厚≈138 nm，誤差<±5 nm。

吸收層：鉻膜厚度10–30 nm，光強衰減率可調（70%–90%）。

2. 轉盤聚光器的光學匹配性

環形光闌參數：

環形寬度與物鏡倍率相關（例如40X物鏡對應環寬約0.5 mm）。

光闌透光區鍍增透膜（MgF?），降低雜散光反射。

聚光鏡NA匹配：
聚光器數值孔徑需略高于物鏡NA（如物鏡NA=1.3，聚光器NA=1.4），確保全孔徑照明。

3. 綠色濾光片的系統優化

與光源的匹配：鹵素燈或LED光源需預裝紅外截止濾光片，避免熱量影響樣本，再疊加綠色濾光片實現單色化。

相位對比增強：單色綠光可減少物鏡色差校正壓力，使相位板設計更專注于單一波長（550 nm）的精準調制。

（激埃特原創圖）

四、光學元件的性能標準與應用案例

1. 國際標準與測試方法

相位板校準：ISO 19012-4規定相位延遲量需通過激光干涉儀檢測（精度λ/100）。

濾光片性能：符合DIN 19011透射光譜測試標準，確保波段準確性。

2. 典型應用場景

活細胞成像（40X物鏡，NA=0.65，綠色濾光片）：

參數要求：物鏡工作距離≥0.6 mm，相位板吸收率80%，避免光毒性。

案例：HeLa細胞分裂過程觀測，時間分辨率達30幀/秒。

材料表面檢測（20X物鏡，長工作距離WD=10.5 mm）：

濾光片選擇：窄帶綠光（550/10 nm）減少金屬表面反光干擾。

相差顯微鏡的四大特殊結構并非孤立存在，而是與光學鏡片深度協同：

環形光闌+聚光鏡透鏡：確保照明光路與相位板精確匹配。

綠色濾光片+物鏡鍍膜：通過單色化提升相位調制精度。

合軸望遠鏡+高精度機械結構：維持光路穩定性。

未來，隨著鍍膜技術（如原子層沉積ALD）與計算光學的發展，綠色濾光片可能被可調諧液晶濾光片取代，相位板延遲量可動態調整，進一步拓展相差顯微鏡的應用邊界。

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