什么是熒光定量PCR、數(shù)字PCR？
| 一、技術(shù)篇 |
在全球醫(yī)療器械行業(yè)中，體外診斷是占比最高的細(xì)分領(lǐng)域之一，根據(jù)診斷原理的不同，體外診斷產(chǎn)品分為分子診斷、免疫診斷、生化診斷等多種類型。其中，分子診斷的靈敏度、特異性、準(zhǔn)確性等均較為突出，尤其是在新冠肺炎疫情全球蔓延的大背景下，以PCR為代表的分子診斷技術(shù)得到了加速發(fā)展。
PCR，即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction）的英文縮寫，是一種以DNA雙鏈復(fù)制原理為基礎(chǔ)，對(duì)特定核酸樣本進(jìn)行體外擴(kuò)增的生物技術(shù)，能夠?qū)⑽⒘康暮怂針颖狙杆倏截愔翈装偃f(wàn)倍，便于后續(xù)的分析研究。該技術(shù)源起于20世紀(jì)70、80年代，經(jīng)過(guò)幾十年的發(fā)展，經(jīng)歷了初代傳統(tǒng)PCR、第二代熒光定量PCR和第三代數(shù)字PCR的演變，在醫(yī)療篩查診斷、生命科學(xué)基礎(chǔ)研究、法醫(yī)分析鑒定及食品衛(wèi)生和環(huán)境檢測(cè)等方面得到廣泛應(yīng)用。
1.熒光定量PCR
實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）技術(shù)，簡(jiǎn)稱qPCR,是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光物質(zhì)（熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性探針），利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。
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與普通PCR相比，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是一次由定性技術(shù)向定量技術(shù)的飛躍。運(yùn)用該項(xiàng)技術(shù)，可以對(duì)DNA、RNA樣品進(jìn)行相對(duì)定量、定量和定性分析。
（圖：熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)過(guò)程） |
2.數(shù)字PCR
數(shù)字PCR即Digital PCR（dPCR)，它是一種核酸分子絕對(duì)定量技術(shù)。相較于qPCR，數(shù)字PCR可讓你能夠直接數(shù)出DNA分子的個(gè)數(shù)，是對(duì)起始樣品的絕對(duì)定量。PCR實(shí)際上是一個(gè)在模板DNA、引物(模板片段兩端的已知序列)和四種脫氧核苷酸等存在的情況下，DNA聚合酶依賴的酶促合成反應(yīng)，擴(kuò)增的特異性取決于引物與模板DNA的特異結(jié)合。
（圖：數(shù)字PCR技術(shù)原理） |
根據(jù)微反應(yīng)單元的不同形式，數(shù)字PCR產(chǎn)品可分為微板式、微滴式和芯片式等。目前，市場(chǎng)上主要的數(shù)字PCR產(chǎn)品主要是基于微滴式和芯片式。
三代核酸檢測(cè)技術(shù)對(duì)比：
技術(shù)方法 | 概念 | 技術(shù)優(yōu)勢(shì) | 技術(shù)劣勢(shì) |
傳統(tǒng)PCR | 采用普通PCR擴(kuò)增儀擴(kuò)增靶基因，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行定性分析 | 1.可實(shí)現(xiàn)特定核酸片段的體外復(fù)制 | 1.相關(guān)核酸染料對(duì)操作人員和環(huán)境具有危害 2.易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果 3.耗時(shí)時(shí)間長(zhǎng)、操作復(fù)雜 4.無(wú)法準(zhǔn)確定量 |
熒光定量PCR | 是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測(cè)每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。通過(guò)內(nèi)參或者外參法對(duì)待測(cè)樣品中的特定DNA序列進(jìn)行定量分析。 | 1.污染風(fēng)險(xiǎn)低 2.操作流程更簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)高效 3.樣品加樣量少 | 1.不同廠家生產(chǎn)的試劑和設(shè)備之間的差異對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響較大，不具備可比性 2.存在背景值的影響，結(jié)果易產(chǎn)生偏差 3.低拷貝的DNA難以檢測(cè) 4.受PCR抑制物的影響較大 |
數(shù)字PCR | 將核酸樣品分配到大量獨(dú)立、平行的微反應(yīng)單元（納升級(jí)）中，部分反應(yīng)單元包含靶標(biāo)分子（陽(yáng)性），而其他不包含（陰性），接著進(jìn)行擴(kuò)增，并利用TaqMan化學(xué)試劑或染料標(biāo)記探針檢測(cè)靶標(biāo)序列，能夠?qū)崿F(xiàn)靶標(biāo)分子的絕對(duì)計(jì)數(shù)。 | 1.特異性強(qiáng)、靈敏度高 2.絕對(duì)定量，準(zhǔn)確性好 3.抗干擾能力強(qiáng) | 1.特異性強(qiáng)、靈敏度高 2.絕對(duì)定量，準(zhǔn)確性好 3.抗干擾能力強(qiáng) |
| 一、光學(xué)原理解決方案篇 |
1.熒光定量PCR
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| （圖：熒光定量PCR光路圖） | |
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| （圖：熒光定量PCR光譜） |
解決方案一：
| 熒光通道 | 激發(fā)波長(zhǎng) | 發(fā)射波長(zhǎng) | 二向色鏡 | 技術(shù)參數(shù) | ||
| Atto425 | Ex 430/10 | Em 480/10 | \ | 設(shè)計(jì)波段 | 300-1100nm@OD6 | |
| FAM | Ex 470/10 | Em 515/10 | \ | 中心波長(zhǎng)誤差 | ±2nm | |
| HEX | Ex 535/10 | Em 565/10 | \ | 半帶寬 | 10±2nm | |
| ROX | Ex 585/10 | Em 614/10 | \ | 實(shí)現(xiàn)方式 | 單片 / 膠合 | |
| CY5 | Ex 630/10 | Em 670/10 | \ | 鍍膜工藝 | 磁控濺射 / 真空鍍膜 | |
| CY5.5 | Ex 682/10 | Em 725/10 | \ | 峰值透過(guò)率 | >85% | |
解決方案二：
| 熒光通道 | 激發(fā)波長(zhǎng) | 發(fā)射波長(zhǎng) | 二向色鏡 | 技術(shù)參數(shù) | ||
| FAM | Ex 470/30 | Em 520/20 | 505二向色鏡 | 設(shè)計(jì)波段 | 300-1100nm@OD6 | |
| HEX | Ex 530/20 | Em 565/20 | 550二向色鏡 | 中心波長(zhǎng)誤差 | ±3nm | |
| ROX | Ex 570/20 | Em 615/20 | 590二向色鏡 | 半帶寬 | 30±3nm、20±2nm | |
| CY5 | Ex 630/20 | Em 675/20 | 647二向色鏡 | 實(shí)現(xiàn)方式 | 單片 / 膠合 | |
| 鍍膜工藝 | 磁控濺射 / 真空鍍膜 | |||||
| 峰值透過(guò)率 | >90% | |||||
2.數(shù)字PCR
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| （圖：數(shù)字PCR光路圖） | （圖：數(shù)字PCR光譜） |
解決方案：
| 熒光通道 | 激發(fā)波長(zhǎng) | 發(fā)射波長(zhǎng) | 二向色鏡 | 技術(shù)參數(shù) | ||
| FAM | Ex 488/20 | Em 527/20 | 505二向色鏡 | 設(shè)計(jì)波段 | 300-1100nm@OD6 | |
| HEX | Ex 527/20 | Em 567/15 | 550二向色鏡 | 中心波長(zhǎng)誤差 | ±2nm | |
| ROX | Ex 572/28 | Em 615/24 | 590二向色鏡 | 半帶寬 | 20±2nm | |
| CY5 | Ex 625/26 | Em 661/11 | 647二向色鏡 | 實(shí)現(xiàn)方式 | 單片 / 膠合 | |
| 鍍膜工藝 | 磁控濺射 / 真空鍍膜 | |||||
| 峰值透過(guò)率 | >90% | |||||